探針法熒光定量PCR試劑盒的存放與使用需特別注意溫度控制、避免污染和正確操作等。該試劑盒主要用于病毒檢測(cè)和研究實(shí)驗(yàn)中對(duì)特定基因表達(dá)量的精確測(cè)定。由于其靈敏度高，任何小的操作失誤都可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

　　首先，在使用前要確保總RNA的完整性和純度。RNA的質(zhì)量直接影響到cDNA合成的效率和后續(xù)PCR的結(jié)果。通過使用NanoDrop 2000或Agilent 2100 Bioanalyzer系統(tǒng)可以檢測(cè)RNA質(zhì)量，而甲醛膠電泳則是一種更為傳統(tǒng)但同樣有效的方法。這些步驟需要在無核酸酶的環(huán)境中進(jìn)行，以防止RNA降解。

　　其次，是優(yōu)化cDNA的合成。實(shí)驗(yàn)室通常采用不同的反轉(zhuǎn)錄方法來獲取cDNA，但其濃度往往需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳稀釋倍數(shù)。這可以通過使用管家基因進(jìn)行常規(guī)RT-PCR來實(shí)現(xiàn)，以確保cDNA的量適合熒光定量PCR的要求。

　　在使用探針法熒光定量PCR試劑盒時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格遵循制造商提供的說明書，并注意以下幾點(diǎn)：

　　1.溫度控制：

　　試劑盒應(yīng)在-20℃下保存，使用前解凍并立即放回冷凍保存。

　　所有反應(yīng)體系配制應(yīng)在冰上進(jìn)行，以保持酶和其他試劑的活性。

　　2.避免污染：

　　所有操作都應(yīng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，工作臺(tái)需紫外照射至少15分鐘以消毒。

　　實(shí)驗(yàn)過程中必須佩戴無菌手套和口罩，盡量避免交談，以防模板污染。

　　3.正確操作：

　　在加樣過程中，建議先加入模板和其他反應(yīng)組分，最后加入Taq聚合酶，以減少酶在室溫下的暴露時(shí)間。

　　使用專用的qPCR光學(xué)管，以避免使用普通PCR管可能帶來的熒光信號(hào)干擾。

　　完成加樣后，建議通過瞬離將反應(yīng)液離至管底，并消除溶液中的氣泡，因?yàn)闅馀輹?huì)干擾熒光檢測(cè)且降低酶活性，從而降低擴(kuò)增效率。