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人ELISA試劑盒如何實(shí)現(xiàn)蛋白、抗體的超靈敏定量？

更新時(shí)間：2025-07-08　點(diǎn)擊量：721

　　人ELISA試劑盒通過優(yōu)化試劑、信號(hào)放大和檢測技術(shù)，實(shí)現(xiàn)蛋白或抗體的超靈敏定量（通常達(dá)pg/mL至ng/mL級(jí)別）。

　　一、人ELISA試劑盒通超靈敏度的核心機(jī)制：

　　1. 高親和力抗體對

　　捕獲抗體與檢測抗體的優(yōu)化：

　　選擇針對目標(biāo)蛋白不同表位的高特異性單克隆抗體（如重組單抗或親和層析純化的抗體），減少非特異性結(jié)合。

　　通過抗體配對篩選（如棋盤滴定法），確保捕獲抗體與檢測抗體的組合信號(hào)輸出。

　　抗體濃度與包被條件：

　　優(yōu)化捕獲抗體的包被濃度和時(shí)間，確保抗原結(jié)合位點(diǎn)充足。

　　使用高吸附能力的載體，提升抗原捕獲效率。

　　2. 酶催化信號(hào)放大

　　辣根過氧化物酶（HRP）底物系統(tǒng)：

　　采用高靈敏度底物（如TMB、ABTS），HRP催化反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物（如TMB氧化后顯藍(lán)色），可檢測低至10^-18 mol的酶活性。

　　通過延長顯色時(shí)間（如30分鐘）或提高反應(yīng)溫度（如37℃），增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度。

　　化學(xué)發(fā)光（ECL）或電化學(xué)發(fā)光（ECL）：

　　使用魯米諾類底物，在HRP催化下發(fā)出光子，通過化學(xué)發(fā)光儀檢測，靈敏度可達(dá)10^-20~10^-24 mol。

　　電化學(xué)發(fā)光（如聯(lián)吡啶釕標(biāo)記）通過電極激發(fā)，背景噪音更低，適合超微量檢測。

　　3. 信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)

　　生物*-鏈霉親和素系統(tǒng)（BA系統(tǒng)）：

　　檢測抗體標(biāo)記生物*，通過鏈霉親和素-HRP復(fù)合物間接結(jié)合，實(shí)現(xiàn)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大（如每一步結(jié)合可放大2~10倍信號(hào)）。

　　納米材料應(yīng)用：

　　使用磁性納米顆粒（如Fe3O4）作為固相載體，增加抗原吸附面積。

　　金納米顆粒或量子點(diǎn)標(biāo)記抗體，通過多信號(hào)輸出（如熒光+比色）提升靈敏度。

　　4. 樣本處理與濃縮

　　血清/血漿預(yù)處理：

　　通過離心、過濾或免疫沉淀（IP）去除高豐度蛋白，降低基質(zhì)干擾。

　　使用蛋白A/G磁珠去除樣本中的非目標(biāo)抗體，避免競爭性抑制。

　　超濾濃縮：

　　對低濃度樣本（如細(xì)胞培養(yǎng)上清）進(jìn)行超濾離心，濃縮目標(biāo)蛋白10~100倍。

　　二、人ELISA試劑盒通實(shí)驗(yàn)操作優(yōu)化：

　　1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)計(jì)

　　梯度稀釋：設(shè)置至少6個(gè)濃度梯度，涵蓋預(yù)期樣本濃度范圍。

　　低濃度擴(kuò)展：在極低濃度區(qū)增加多點(diǎn)，擬合非線性曲線。

　　2. 孵育條件優(yōu)化

　　延長抗原-抗體反應(yīng)時(shí)間：捕獲抗體與抗原的孵育時(shí)間從1小時(shí)延長至2~3小時(shí)，確保低濃度抗原充分結(jié)合。

　　封閉液選擇：使用含BSA、酪蛋白或Tween-20的封閉液，封閉板內(nèi)非特異性結(jié)合位點(diǎn)，降低背景噪音。

　　3. 信號(hào)讀取與數(shù)據(jù)分析

　　酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)置：

　　比色法：選擇雙波長檢測。

　　化學(xué)發(fā)光：積分時(shí)間設(shè)為1~10秒，避免信號(hào)飽和。

　　數(shù)據(jù)擬合：

　　使用四參數(shù)邏輯擬合（4PL）替代線性回歸，準(zhǔn)確計(jì)算低濃度樣本值。

　　設(shè)置閾值，排除背景干擾。